PCR

Fra Wikipedia, den frie encyklopaedi

(Omdirigeret fra PCR-test)

For alternative betydninger, se PCR (flertydig). (Se ogsa artikler, som begynder med PCR)

Baby Blue - en prototype til en PCR-termocykler fra omkring 1986

PCR (polymerase chain reaction) er en DNA-opformeringsteknik, der har mange anvendelser i molekylaer- og mikrobiologi samt diagnostik, jvf. test for smitte med coronavirus.^[1]

Princippet i teknikken er, at man har to stykker DNA, der er komplementaere til enderne af det gen eller andet DNA, der onskes opformeret (amplificeret). Disse sma stykker DNA kaldes primere, idet de bruges til at prime (af engelsk: "starthjaelp") processen. De to primere binder pga. komplementariteten til hver ende af genet, og forlaenges herefter ved brug af en DNA polymerase, et enzym, der bruger enkelte nukleotider til at kopiere DNA. Det dannede stykke DNA kan nu indga i en ny primerreaktion, hvorved processens hastighed bliver eksponentielt stigende. ^[2]

Skematisk tegning af PCR-cyklus. (1) Denaturering ved 94-96 degC. (2) Annealing ved ~65 degC (3) Elongation ved 72 degC. Fire cykli er vist her. De bla linjer repraesenterer DNA skabelonen, til hvilken primerene (rode pile) pasaetter sig (annealing), der er forlaenget af DNA polymerase (lysegronne cirkler), der giver kortere DNA produkter (gronne linjer), der sa selv bruges som skabelon nar PCR-processen fortsaetter.

En vigtig anvendelse af PCR er til "kloning" af gener, dvs. indsaetning af gener i andre organismer. Typisk indsaettes et fremmed gen i bakterier som Escherichia coli eller alm. bagegaer (Saccharomyces cerevisiae), men teknikken kan ogsa bruges pa planter og hojerestaende organismer og dyr.

En anden vigtig anvendelse af PCR er til detektion og identifikation af mikroorganismer. Denne teknik kan pavise indtil ganske fa genkopier (specifikke nukleinsyresekvenser/DNA) fra mikroorganismen og dermed hjaelpe med til at identificere organismen i laboratoriet. Dette bruges normalt til pavisning af mikroorganismer som er umulige eller vanskelige at dyrke, som f.eks. Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae.

Kary Mullis fik i 1993 tildelt en halv Nobelpris for at opfinde PCR-teknikken.^[3]

Taq polymerase

[rediger | rediger kildetekst]

I 1980'erne, da PCR-teknikken var i sin udvikling stodte man hurtigt ind i et problem. Efter hver replikation matte oplosningen varmes op til over 90degC for at denaturere de ny-formede dobbeltstrengede DNA molekyler. Denne opvarmning medforer dog ogsa en denaturering af enzymet DNA polymerase, der skal bruges i naeste replikationscyklus. Derfor skulle der efter hver opvarmning tilfojes nye enzymer, der var med til at gore processen dyr og langsommelig. Man fandt dog hurtigt en losning - Taq-polymerase. Taq polymerase, eller Taq pol, som det ofte forkortes, stammer fra det termofile bakterie Thermus aquaticus. T. aquaticus er et bakterie, der lever i varme kilder, og har det bedst ved temperaturer over 70degC. Dette har medfort en evolutionaer fordel for individer med enzymer, der er resistente mod hoje temperaturer. Som et resultat af dette har Taq pol optimale forudsaetninger for DNA replikation ved temperaturer omkring 80degC samt ingen problemer med at forblive aktivt, selv ved opvarmning helt op mod 100degC.^[4]^[5]

Brugen af Taq pol, frem for polymerase fra E. coli (der tidligere anvendtes), var altsa med til at muliggore en lettere og billigere PCR udforsel ved hojere temperaturer. Desuden viser det sig, at den hojere temperatur, nu ogsa under DNA-replikationsfasen, medforer hojere specificitet for de sakaldte primere og en mindre produktion af uonskede bi-produkter.